TRABAJO PRACTICO N°1: Microscopia y técnicas histológicas
TRABAJO LABORATORIO N°1
Conceptos de microscopia y técnicas histológicas
MICROSCOPIO
PARTE MECANICA
• Pie
• Columna o brazo
• Tubo
• Platina
• Tornillo micrométrico y macrométrico
• PinzasPARTE OPTICA
• Fuente de luz• Condensador con diafragma: lente convergente que condensa la luz regulado con el diagrama que concentra la luz.• Lentes ocular y objetivo (montadas en el revolver): todas son lentes convergenteso Lente ocular: aumento 10x. Da una imagen aumentada, real e invertida.o Lente objetivo: aumento 2,5X (objetivo de campo), 10X (objetivo seco débil), 40X (objetivo seco fuerte) o 100X (objetivo de inmersión)- El calculo del aumento final es multiplicar la magnificación del lente ocular por el objetivo.
LIMITE DE RESOLUCION Y PODER RESOLUTIVO
El límite de resolución (LR) es la menor distancia a la cual dos puntos pueden distinguirse como tales, valor medible. El límite de resolución es directamente proporcional a la longitud de onda de la luz.
El poder resolutivo (PR) es la capacidad del instrumento para distinguir dos puntos muy cercanos, valor no medible. El poder resolutivo es inversamente proporcional al límite de resolución, y es independiente del aumento de las lentes.
El ángulo de apertura es el ángulo limitado por los rayos más periféricos que parten del objeto y penetran en la lente para formar la imagen. Mientras m‡s rayos pasen por la lente, más nitida se vera la imagen.
TECNICA HISTOLOGICA
1. Obtención del tejido o muestra
2. Fijación
El volumen del fijador debe ser por lo menos 10 veces más que el volumen de muestra. Tiene por objetivo fijar la estructura, impidiendo fenómenos de autolisis de necrosis celular.
Los fijadores m‡s comunes son el formaldehido y glutaraldehido, compuestos hidrosolubles.
3. Deshidratación
Para retirar los compuestos hidrosolubles que puedan diferenciarse de la parafina se deshidrata la muestra. Se la hace mediante pasajes en alcoholes de graduación creciente, para después terminar en la inclusión en xilol que desplaza al alcohol y es un solvente órganico.
4. Inclusion
Se embebe la muestra en parafina y se obtiene el taco.
5. Corte
Se corta la muestra en un microtomo.
6. Desparafinación e hidratación
Para permitir la coloración (solución acuosa) es necesario la desparafinación mediante xilol, y se procede a hidratar la muestra con soluciones de alcohol crecientes para después pasar a agua destilada.
7. Coloración
Dependiendo la acidez o basicidad de la muestra se puede colorar con distintos colorantes. Los m‡s usados son eosina (rosa) y hematoxilina (azul). La hematoxilina es un colorante basico, por lo cual acepta protones y queda cargado de forma positiva (colorante cationico); por lo tanto es acidofilo, o sea, reconoce sustancias acidas: ej. acidos nucleicos. En tanto la eosina es un colorante acido, por lo cual cede protones y queda cargado de forma negativa (colorante anionico); por lo tanto es basofilo, o sea, reconoce sustancias básicas: ej. proteinas de membrana.
8. Deshidratación
Dado que durante la coloración se está en un medio acuoso es necesario deshidratar nuevamente en alcoholes de graduación creciente para después sumergir en xilol.
9. Montaje
TECNICAS CITOQUIMICAS E HISTOQUIMICAS
A) Metacromasia
La metacromasia es una propiedad de algunos componentes químicos de las células y tejidos de cambiar el color del colorante empleado. Se da en colorantes cationicos. Cuando las moléculas del colorante catiónico se unen a su superficie, constituyen un polímero que cambia de color (haciendo que cambie la longitud de onda de la luz refractada y por tanto el color, de azul a un color rojo violáceo).
La metacromasia no es una técnica histoquímica propiamente dicha, pero puede emplearse para identificar algunos componentes químicos si previamente se somete el tejido a la acción de enzimas que digieren moléculas que se sabe son metacromáticas.
B) Coloracion con el reactivo de Schiff: PAS (periodic acid Schiff)
El reactivo de Schiff es una fucsina básica que se decolora en presencia de ácido sulfuroso. Cuando este reactivo se pone en contacto con el aldehído, toma un color magenta intenso. Su empleo sobre los tejidos permite la identificación de aldehídos libres, conocida como reaccion plasmal.
La reacción de PAS permite visualizar glúcidos de todo tipo, glucógeno y glucoproteínas en los tejidos a los que tiñe de color magenta.
C) Tricromico de Masson
El tricrómico de Masson emplea hematoxilina de Mayer, fucsina Ponceau y azul de anilina. Tiñe los núcleos de color azul, los citoplasmas rojos, las fibras colágenas de color celeste, los glóbulos rojos y el músculo de color fucsia.
D) Tricromico de Mallory
Es una técnica que emplea fucsina ácida, azul de anilina y Naranja G. Tiñe las fibras colágenas, reticulares, la matriz extracelular del cartílago y el hueso de color azul; los citoplasmas, núcleos y músculos, en distintas tonalidades de rojo, y las fibras elásticas y hematíes, de color amarillo.
En las siguientes imagenes se puede observar un higado de rata en coloracion de tricromico de Mallory en 400X.
Muy Bien Sofía! La lente de 100x es de inmersión, no inversión. Hermosas fotos! en qué aumento las tomaste?
ResponderBorrarBuenas tardes profee, ya hice las correcciones correspondientes. Muchas gracias!
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